Karakteristik Asetosal
August 2, 2012
Uji Enzim dengan Jenis Bakteri yang Berbeda dalam Purifikasi dan Preparasi Analisis Enzim Proteolitik #4
August 2, 2012

Purifikasi Enzim dalam Purifikasi dan Preparasi Analisis Enzim Proteolitik #3

Purifikasi enzim dengan cara memfiltrasi pada suhu 40C, sebelumnya dilakukan presipitasi denga aseton. 1,5 volume aseton didinginkan pada suhu -150C dan ditambahkan perlahan dengan pengadukan. Setelah 24 jam presipitat dipisahkan dengan sentrifugasi 1600 X g selama 30 menit. Presipitat dilarutkan dengan 0,025 M Tris buffer, pH 9,0 dan didialisis dengan buffer selama 24 jam pada suhu 40C.

4.1.            Metode Filtrasi Gel

Enzim dimurnikan dengan filtrasi gel. Presipitasi denga aseton, preparasi dengan dialisis enzim dari A 29 dan A60 dapat dilarutkan kembali ke masing-masing 3 puncak aktifitas enzim. Aktifitas proteolitik dari tiap puncak dianalisis setelah konsentrasi protein mencapai 200?g/ml. Berat molekul dari tiap fraksi enzim ditentukan  dengan perbandingan volume dengan protein yang telah diketahui berat molekulnya. Protein yang berat molekulnya terstandarisasi dengan kolom dengan ketentuan dari literatur adalah sebagai berikut : sitokrom c, ribonuklease, lisozim, dan tripsin; soyabean tripsin inhibitor, ovalbumin, serum albumin, dan gamma globulin; insulin. Kurva diplot seperti aliran volume vs berat molekul dari setiap grade dari sephadex. Kurva dapat diekstrapolasikan termasuk point eksperimental untuk volume enzim. Berat molekul dari puncak aktif enzim dari A29 dan A60 berkisar antara 21.500 sampai 23.800.

4.2.            Metode Elektroforesis

Presipitasi enzim dengan aseton, yang diikuti dengan dialisis dilakukan dibawah kondisi vakum sampai konsentrasi protein adalah 10 mg/ml. Sebanyak 10 ?L diaplikasikan pada tanda garis dari selulose asetat. Pola dari pita protein  dari dua jenis mikroorganisme  adalah sama. Didapatkan bahwa fraksinasi dengan buffer veronal menghasilkan hasil yang paling baik. Aktifitas proteolitik diperiksa pada pH 7,0 pada kedua tamda garis. 1 garis diwarnai sedangkan garis lainnya di eluasi dengan 0,5 ml dari buffer Tris dan dianalisis untuk aktifitas proteolitik. Pita yang paling mendekati katoda adalah jenis yang paling aktif.

Untuk mengkorelasikan hasil dari elektroforesis dari presipitasi dengan aseton , dialisis enzim dan filtrasi gel sephadex, puncak aktif dari filtrasi gel diikuti dengan dialisis enzim dari masing-masing enzim diperbolehkan untuk dilakukan pada selulose asetat elektroforesis dengan buffer veronal  pada pH 7,0 . Protein aktif dari filtrasi gel sephadex dikorespondensikan dengan elektroforesis dan presipitasi dengan aseton.