Kerja dan Stabilitas Enzim dalam Purifikasi dan Preparasi Analisis Enzim Proteolitik #6
August 2, 2012
Produksi Oksitetrasiklin Dengan Immobilisasi Streptomyces rimosus #1
August 2, 2012

Prosedur Percobaan PinA Menghambat Degradasi Hidrolisis ATP-Tergantung Degradasi Protein oleh Lon Protease #2

Prosedur Pemurnian dan Metode Standar.

Pemurnian PinA dan Lon, uji untuk degradasi casein, komposisi buffer, dan metode untuk SDS-PAGE dan filtrasi gel yang dijelaskan pada bahasan sebelumnya. Suatu sistem regenerasi ATP terdiri dari 50 mM kreatin fosfat dan 20?g/ml fosfokreatin kinase digunakan pada beberapa uji.

 

Degradasi dari CcdA dan N protein.

Bakteriofag N protein dimurnikan dan didegradasi seperti yang diuraikan sebelumnya. Untuk proses degradasi, 2?g N protein ditambahkan pada 250 ?l buffer yang mengandung 50mM Tris-HCl,pH 8.0 pada suhu 25 0C, 25 mM MgCl2, 1mM DTT dan 4mM ATP; pada uji yang lain, 0.5 mM AMPPNP atau H2O deionisasi disubtitusikan untuk ATP. Larutan tersebut diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37 oC dan degradasi dimulai dengan penambahan 2?g Lon. Setelah 45 menit pada suhu 37 oC, reaksi diakhiri dengan penambahan 310?l asam trikloroasetat 10% yang dingin. Protein yang tidak larut dikumpulkan dengan disentrifuse selama 15 menit pada 14000 x g dengan sentrifuse Eppendorf.Endapannya dicuci dua kali dengan 0.5 ml aseton,udara panas, dan dilarutkan dalam 10?l sampel buffer SDS-PAGE. Protein dipecah dengan SDS-PAGE,diwarnai dengan Coomassie Blue, dan diukur dengan dibaca pada densitometer Pharmacia-LKB UltroScan XL menggunakan software GelScan XL.

Pemurnian CcdA dan sintetis CcdA41, terdiri dari carboxyl-terminal 41 amino acids dari CcdA, yang didegradasi oleh Lon protease.Untuk pengukuran CcdA dan degradasi CcdA41, reaksi dihentikan dengan 4M guanidin HCl dan produk degradasi dianalisis dengan kromatografi peverse phase.

 

Uji aktifitas peptida.

Pemecahan peptida fluorogenic, glutaryl-Ala-Ala-Phe-MNA,diuji dalam suatu larutan yang mengandung 50mM Tris-HCl, pH 8.0 pada suhu 25 oC, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 4mM ATP, 50 ?M peptida, 1?g Lon, dan 5?g ?-casein. 50 ?l campuran reaksi diinkubasi dalam tempat yang gelap pada suhu 37 oC selama 20 menit, setelah itu reaksi diakhiri dengan penambahan 0.2 M Sodium borate, pH 9.1, dan 2mM EDTA. Fluorescence dibaca pada fluorometer Parkin-Elmer LS-3B pada panjang gelombang eksitasi 335nm dan pada panjang gelombang emisi 415 nm. Untuk memeriksa efek nokleotida pada aktifitas peptidase,menghilangkan nukleotida, atau 50 ?M AMPPNP disubtitusikan pada ATP.

 

Uji aktifitas ATPase

Aktifitas ATPase diukur berdasarkan pelepasan [32P]orthophosphate dari [?32P]ATP. Campuran reaksi (50 ?l) mengandung 50mM Tris-HCl, pH 8.0 pada suhu 25 oC, 25mM MgCl2, 1 mM DTT dan 1mM [?32P]ATP ( aktifitas spesifik 2 ?Ci ?mol-1). Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37 oC selama 5 menit, dan reaksi dimulai dengan penambahan 1 ?g Lon. Setalah 20 menit, reaksi diakhiri dengan penambahan 200 ?l larutan penghenti dingin yang terdiri dari 1:1 campuran 5 mM asam silicotungstic dalam 1M H2SO4 dan 5% ammonium molibdate dalam 2M H2SO4. Phosphomolybdate diekstraksi dengan 0.5 ml solven yang mengandung 1:1 campuran isobutanol dalam toquen, dan disentrifuse selama 3 menit pada 14000 x g pada suhu 4 oC. Fase organik mengandung [32P]orthophosphate (250?l) yang dihitung dalam 10 ml cairan Scintiverse BD scintillation ( Fisher).