Produksi Oksitetrasiklin Dengan Immobilisasi Streptomyces rimosus #1
August 2, 2012
MENCEGAH KOLESTEROL TINGGI
August 2, 2012

Bahan dan Metode dalam Penelitian Produksi Oksitetrasiklin Dengan Immobilisasi Streptomyces rimosus #2

A.1 Bahan

Mikroorganisme

Streptomyces rimosus TM-55 (CCRC 940061) disediakan oleh Cyanamid Taiwan Corporation (Taiwan) untuk produksi oksitetrasiklin.

Bacillus subtilis ATCC 6633 yang diperoleh dari American Type Cultur Collection (Rockville,MD,US) untuk pengujian antimikroba.

A.2 Metode

A.2.1  Media kultur dan kondisi pertumbuhan

Streptomyces ditanam pada media ekstrak yeast (ragi) dextrosa (YD-medium) yang berisi ekstrak yeast (ragi) 10 g/L, dan agar 18 g/L pada pH 7 ± 0.1 suhu 28oC selama 2 hari. Miseliumnya dipindahkan ke media sintetik (S-medium) yang terdiri dari glukosa 10 g/L, ekstrak yeast (ragi) 4 g/L, Bacto pepton 4 g/L, MgSO4.7H2O 0.5 g/L, KH2PO4 4 g/L, dan glisin 20 g/L pada labu Erlenmeyer 250 ml suhu 28oC dengan 150 putaran/menit selama 1 hari sampai terjadi fase stationary (absorban 4-4.5 pada panjang gelombang 660 nm). Kemudian miseliumnya dipanen dengan sentrifugasi pada 1000 x g (Model 2010, Kubota, Japan) selam 30 menit. Untuk kultur benihnya, sebagian dari miseliumnya (2%v/v) dipindah ke media tryptic-soy broth (TSB) (Merck, Sharp & Dohme, Darmstadt, Jerman) yang berisi Bacto dextrosa 2.5 g/L, Bacto trypton (kasein dari pankreatik) 17 g/L, Bacto soyton (tepung kedelai dari pancreatik) 3g/L, NaCl 5 g/L, K2HPO2.5 g/L, dan glisin 20 g/L pada  labu Erlenmeyer  dan ditanam pada suhu 28oC selama 2 hari.

Media fermentasi oksitetrasiklin terdiri dari starch (yang larut) 20 g/L, kalsium karbonat 6 g/L, dan minyak kedelai 2 ml pada pH 7.9 [17]. Potensi oksitetrasiklin sebagai antibiotik ditentukan oleh agar No.1 (Merck, Sharp & Dohme) yang berisi ekstrak daging 1.5 g/L, ekstrak yeast (ragi) 3 g/L, pepton dari kasein 4 g/L, pepton dari daging 6 g/L, glukosa 1 g/L, dan agar 15 g/L pada pH 6.5 ± 0.1 [20].

 

A.2.2   Fermentasi

Sel ditanam pada S-medium (media sintetik) sampai menuju pertengahan fase logarithmic (absorban, 2.5-3 pada panjang gelombang 660 nm). Suspensi 5% (v/v) mycelium  diinokulasi (disuntikkan) pada 100 ml media fermentasi oksitetrasiklin dan ditanam pada labu Erlenmeyer 500 ml pada suhu 28oC dan diputar 150 putaran/menit dan dikocok selama 10 hari. Semua penelitian di replikasi 3 kali, dihitung rata-rata dan standart deviasinya (SD).

 

A.2.3   Immobilisasi

Pada volume yang sama suspensi miselium dan sodium alginat 4% dicampur dengan hati-hati dengan menggunakan magnetic stirrer selama 30 menit, dan percampurannya menggunakan pompa peristaltik dengan kecepatan 3ml/menit, kemudian untuk immobilisasi miseliumnya dimasukkan kedalam larutan  kalsium karbonat 2%.

 

A.2.4   Pelepasan antibiotik pada immobilisasi beads

Pada volume yang sama sodium alginat 4% dan oksitetrasiklin dengan konsentrasi yang berbeda dicampur dan immobilisasi pada suhu 25oC. Beads dengan variasi konsentrasi dari antibiotik yang diambil dari antibiotik agar No.1 dengan organisme uji  B. subtilis diinkubasi pada suhu 30oC selama 5 hari. Diameter dari zona hambat diukur setiap hari, dan diamati pertumbuhan mikrobanya pada agar plate.

 

A.2.5 Penentuan nukleotida adenin

Massa sel dididihkan dengan Tris buffer 0.02 M pH 7.6 selama 10 menit. Nukleotida adenin diukur setelah difiltrasi dengan kertas saring millipore 0.46 µm yang dijelaskan oleh Sparling et al [21]. Ekstrak firefly lantern (kunang-kunang) berisi luciferin dan luciferase (Sigma, US) yang dilarutkan pada 5 ml Tris buffer 0.02 M pada pH 7.6 dan 1 ml MgSO4.7H2O 0.01M (yang dilarutkan pada Tris buffer 0.02 M) dan disimpan semalam pd suhu 4oC. Sebelum diukur, larutan enzim disentrifugasi 3000 x g selama 10 menit, dan digunakan tidak lebih dari 2 jam [22]. Sampel atau standar nukleotida adenin dicampur dengan campuran luciferin-luciferase, dan emisi cahayanya diukur dengan photometer adenosine triphosphate (ATP) (Turner TD-20e Luminomer, Sunnyvale, CA,US). Konsentrasi nukleotida adenin dihitung dari kurva standar dari komponen aslinya.

 

A.2.6 Pengukuran oksitetrasiklin

Potensi antimikroba ditentukan dengan metode paper disk (cakram kertas) (diameter 8 mm; Tokyo Seisakusho, Japan) dengan B. subtilis sebagai organisme uji pada antibiotik agar No. 1 suhu 30oC selama 8-24 jam [5, 20]. Setiap milliliter (ml) larutan berisi 5 x 106 spora organisme uji, dan setiap paper disk (cakram kertas) berisi sampel 35 µl atau standar antibiotik. Persamaan regresi yang diperoleh adalah Y = 0.11682 X – 1.67709 dan r2 = 0.9962, dimana Y adalah log konsentrasi dari oksitetrasiklin dan X adalah diameter zona hambat. Untuk analisis kualitatif dan kuantitatif dari antibiotik, sampelnya disaring dengan kertas saring millipore 0.46-µm diukur dengan kromatografi cair Shimadzu LC-5A (Shimadzu, Japan) menggunakan kolom Lichosphere 60 RP-Select B (5 µm) dengan fase gerak campuran metanol, acetonitril dan asam oksalat perbandingan 0.8 : 1.0 : 3.2. kecepatan alir 1 ml/menit, detektor (Shimadzu) SPD-2A pada panjang gelombang 350 nm, dan konsentrasinya dihitung dangan integrator C-R6A (Shimadzu). Oksitetrasiklin, tetrasiklin, dan klortetrasiklin yang murni digunakan sebagai standar dengan range antara 1 sampai 1000 µg/ml.

A.2.7 Metode lain

Untuk kultur broth, penentuan pH diukur secara langsung dengan pH meter (Model 2002, Good, Taiwan). Biomassa sel diukur dengan spektrofotometer (Spektrofotometer U-2000, Hitachi, Japan) pada panjang gelombang 660 nm. Sel dipanen dengan sentrifugasi pada 10000 x g selama 20 menit dan dicuci dua kali dengan air suling. Berat kering sel ditentukan dengan cara pengeringan pada suhu 105oC semalam kemudian diukur berat sampai berat konstan.

Incoming search terms:

  • manfaat oksitetrasiklin
  • cara uji kadar oksitetrasiklin
  • artikel media spesifik streptomyces
  • panjang gelombang adenin
  • pengertian oksitetrasiklin
  • peran streptomyces rimosus
  • penelitian tentang bakteri streptomyces rimosus
  • proses pembuatan streptomyces
  • gambar bakteri streptomyces rimosus
  • alat uji kualitatif antibiotika